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ELISA試劑盒操作步驟復雜，操作不當將引起較大的誤差。以下敘述各個步驟中的影響因素。
1.加樣
2.溫育
3.洗滌
4.顯色
5.比色

1．試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。 

2． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。 

3． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。 

4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，ELISA試劑盒避免使用帶金屬部分的加樣器。 

5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。 

6． 洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。 

7． 底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。 

8． 加入試劑的順序應一致，ELISA試劑盒以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。 

9． 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。